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发布时间：2022-07-09
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实验进展书面报告
一．实验目标
1.帮助师兄纯蛋白并进一步熟练纯蛋白的实验操作技能。
2.手提质粒，测质粒浓度
3.学习测p450酶蛋白的浓度
4.掌握基因定点突变的原理和基因定点突变完整的实验操作流程。
二．实验进展
1.纯蛋白的实验操作过程：
（1）4度，4000-8000rpm,15-30分钟，收集菌体，沉淀可冻于-80度保存。
（2）配制lys buffer,wash buffer,desalting buffer,最后配制elution buffer 溶液，调节PH时要精确。
（3）加入适当的lys buffer,1000毫升菌液收集的菌体，加入30毫升即可，太少超声时容易起泡。
（4） 混合震荡，没有块状，成为均匀的溶液。（菌体要放在冰上）
（5）往冰桶里面加冰，超声细胞破碎仪进行破碎菌体，开2.0秒。关4.0秒。超声破碎时间30分钟。（在进行超声细胞破碎时，一定要把小烧杯边缘卡在线圈的地方）
（6）用离心机离心掉菌体（离心1小时，10000rpm）.去除菌体碎片，取上清备用，(一定不要菌体碎片，上清液包括蛋白质，细胞内容物，lysbuffer缓冲液)
(7)洗 Ni 柱，假设有乙醇，用清水进行洗第一遍，再用lys buffer 洗一遍，留点 lys buffer 液体，lys buffer 液体与蓝色体积1:1比例，使Ni 柱重悬起来，加Ni柱，（500毫升培养基加2毫升Ni柱，1升的培养基加3-4，5毫升NI柱。500毫升培养基加3毫升Ni柱。）
（8）将加过Ni 柱的上清液放在4度，使其充分动态混合，转速不可太快，保护Ni 柱，使Ni柱和上清液充分融合，进行孵育。
（d） 37 度摇床1 小时，
（e） 离心浓缩，去除部分上清液后与沉淀混合均匀后涂布，具体操作（剩余50-100 ul，然后吸取一半的菌液进行涂布平板）100毫升LB培养基倒四个板子，吹板子吹十分钟。
（f） 37度培养后根据菌落进行筛选（卡纳抗性）
（g） 在2ml 的EP管中加入1.8ml的LB 培养基和相应的抗生素之后，挑取单克隆菌落，进行摇菌培养。
（h） 提取质粒DNA.
8）测序
验证目的基因的碱基顺序
9）保菌和划板
10) 挑取单克隆摇菌培养作为种子液，
11）发酵
12）纯蛋白
13) 酶反应
14）液相检测
三．实验总结
1．进一步熟练实验室中的基本实验操作技能，在做转化操作时要保证严格的无菌操作！做实验过程中要认真。
2.基因的定点突变做到纯蛋白这一步骤，后续的酶反应和液相检测及产物的分析，是潘师兄做的，我跟着进一步学习，基因的定点突变做了三个包括（Pikc-E48Y；Pikc-N392Y；Pikc-U242Y）；三种基因的定点突变，均纯到蛋白。
四．未来计划
1.继续学习实验操作技能，重点在HPLC的独立使用，和引物的设计。
2.帮助师兄发酵和纯蛋白。
3．熟练掌握更多的定点突变，并进行深入的思考和总结。
4.学习理论知识，细读文献。
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